遠(yuǎn)場熒光顯微技術(shù)普遍應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域。標(biāo)準(zhǔn)的遠(yuǎn)場熒光顯微技術(shù)的分辨率受衍射極限公式 d=/(2NA)所限制。其中，λ是入射光的波長，NA為物鏡的數(shù)值孔徑。 受激發(fā)射損耗（STED）顯微技術(shù)克服了衍射極限問題，該技術(shù)利用鈦寶石和固體半導(dǎo)體激光組合，將圖像分辨率提升到了大分子水平。這項(xiàng)嶄新的遠(yuǎn)場熒光納米顯微技術(shù)，已經(jīng)應(yīng)用于很多前沿科學(xué)研究中，特別是生命科學(xué)領(lǐng)域。在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下，一組強(qiáng)度足以激化熒光體的脈沖激光，通過物鏡聚焦到衍射極限的光影，與另一組STED光束重疊。 STED光束的中心為零能量，周圍是很陡的能量邊沿，其橫截面的形狀像中空的甜香餅。STED光束與激化光束同步或相差數(shù)皮秒到達(dá)同一焦平面；激化光束迅速“熄滅”被STED激化的分子；隨后，把STED光束波長微調(diào)到熒光體光譜的紅光邊沿，同時(shí)將脈沖頻寬調(diào)整在熒光體發(fā)光時(shí)段內(nèi)，即1～5ns，效果最為理想。 熒光染色分子發(fā)射的機(jī)率隨著STED的脈沖能量而降低；基于此現(xiàn)象，染色分子發(fā)射熒光的能力將受次衍射中心光環(huán)范圍的約束，規(guī)范了顯微鏡的有效“點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)”（Point Spread Function，PSF）。觀察樣品衍射極限以外的范圍，可以通過激光掃描顯示樣品的全貌。 如果能量強(qiáng)度Is可以把50%熒光體強(qiáng)度降低，它的半高全寬（FWHM）在焦平面的有效“點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)”PSF大約為r ≈ λ/(2NA1+I/Is)，典型的有機(jī)染劑強(qiáng)度Is值大約為10～30MW/cm2。 松散的三重態(tài)（Triplet-state Relaxation，簡稱T-Rex）或松散的黑暗態(tài)（Dark-state Relaxation，簡稱D-Rex）STED顯微技術(shù)是高效的改良型STED顯微技術(shù)，也是目前為止能提供最高分辨率的顯微技術(shù)。其原理是降低或消除光漂白現(xiàn)象，其中重點(diǎn)是避免產(chǎn)生三重態(tài)。實(shí)際上，就是確保兩個(gè)連續(xù)脈沖波的時(shí)段大于熒光體所激化的超穩(wěn)定黑暗態(tài)的平均存在時(shí)間。由于這種黑暗態(tài)存在的平均時(shí)間在微秒量級(jí)，只要脈沖的重復(fù)頻率小于1MHz，就可以確保這種黑暗態(tài)在隨后的兩個(gè)連續(xù)脈沖到達(dá)前松散。光漂白是產(chǎn)生黑暗態(tài)的主要因素，松散的三重態(tài)能減低熒光染劑的光漂白的形成；從計(jì)量的角度看，就是促使I/Is有更大比值、而使r值更? ? 建立一個(gè)松散的三重態(tài)和波長可調(diào)的激化耗損的激光設(shè)定，一般通過鎖模的鈦寶石激光光源，從震蕩器泵浦一個(gè)可再生的放大器，再輸入一個(gè)光纖參量放大器（OPA）來提供所需的可見光波長。整套設(shè)備成本通常超過50萬美元。另外，這套設(shè)備所提供的脈沖在200～300fs之間，而STED顯微技術(shù)需要寬度在0.1～2ns之間的脈沖。要縮小脈沖頻寬差距，需要安裝光柵和其他光學(xué)元件，隨之也會(huì)增加系統(tǒng)復(fù)雜性，并會(huì)涉及到經(jīng)常性的檢查和系統(tǒng)維護(hù)，這也使STED顯微技術(shù)變成了“貴族化”技術(shù)。 2006年德國馬克斯·普朗克協(xié)會(huì)（Max Planck Institute）使用高能量超連續(xù)激光器提供激化和STED光源，為開發(fā)高效、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的STED顯微技術(shù)打開了大門。一臺(tái)高能量超連續(xù)激光器，價(jià)格只是鈦寶石固體激光器的1/5，它可以直接實(shí)現(xiàn)T-Rex STED顯微技術(shù)，將圖像分辨率有效提高到30～50nm水平。高能量超連續(xù)激光光源，在大約20nm的帶寬范圍內(nèi)，能量強(qiáng)度大于20nJ，STED光束中心焦點(diǎn)縮小到10-9cm2以內(nèi)，中心焦點(diǎn)范圍的能量強(qiáng)度I也達(dá)到數(shù)個(gè)GW/cm2。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 圖1顯示了STED顯微鏡的設(shè)計(jì)圖。Fianium公司提供的SC450-PP-HE超連續(xù)激光光源，其光束的帶寬、脈沖、儀器反應(yīng)函數(shù)（IRF）等參數(shù)均符合STED顯微技術(shù)的要求。激化和STED光束來源于同一共振器，所以基本同步，無需調(diào)整。除了激光光源和共軛焦顯微鏡所需的光學(xué)元件外，STED納米顯微鏡的設(shè)計(jì)只需添加一些在市場上可以購買到的光學(xué)元件，就完全可以運(yùn)作了。 圖1：STED納米顯微鏡的設(shè)計(jì)。使用帶寬可調(diào)的超連續(xù)單一光源，將STED顯微技術(shù)中所需的激化和損耗光束最佳化。實(shí)驗(yàn)討論 圖2是通過圖1的設(shè)計(jì)，只使用一般的有機(jī)染劑所擷取的圖像。圖片顯示，使用共軛焦顯微技術(shù)的圖像不大清晰，而STED顯微技術(shù)則把哺乳類細(xì)胞的微管狀組織和稠密的納米粒子的圖像分辨率提升到30～50nm水平，超過光學(xué)衍射極限8～9倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，T-Rex STED顯微技術(shù)（或稱為“遠(yuǎn)場熒光納米顯微技術(shù)”）可以通過一臺(tái)超連續(xù)激光器來實(shí)現(xiàn)，其獲得的圖像分辨率足以滿足諸多科研領(lǐng)域的應(yīng)用需求。目前的設(shè)計(jì)，只將超連續(xù)光源的一半能量用于了STED光源，將來可以考慮引用余下的能量作為Z軸的激化光源，或者用作設(shè)計(jì)另外色譜的頻道。預(yù)期超連續(xù)光源的應(yīng)用將拓展到發(fā)射藍(lán)光和綠光的染劑，這意味著大部分熒光染劑，都可以應(yīng)用于T-Rex STED顯微技術(shù)。 圖2：用共軛焦顯微技術(shù)和STED顯微技術(shù)所獲得的圖像對(duì)比。實(shí)驗(yàn)樣品為管狀細(xì)胞組織 （免疫標(biāo)記）。為了滿足科研市場對(duì)顯微技術(shù)的需求，超連續(xù)激光光源的各種參數(shù)將不斷優(yōu)化，以配合不同的熒光染劑和光學(xué)元件的使用，從而使STED顯微技術(shù)能切實(shí)地普及到各個(gè)科研領(lǐng)域。 參考文獻(xiàn)： 1. STED microscopy with supercontinuum laser source, Dominik Wildanger, Eva Rittweger, Lars Kastrup and Stefan W. Hell, 23 June 2008/Vol.16, No. 13/OPTICS EXPRESS 9614. 2. STED application notes, Fianium Ltd., www.fianium.com.